Struttura Cryo-EM di un canale rutilante blu da Klebsormidium nitens e le sue potenzialità biotecnologiche

Struttura del canale blue-shifted di channelrhodopsin KnChR

Nel contesto della ricerca sui canali ionici e le loro applicazioni nella neuroscienza, il channelrhodopsin blu-shifted KnChR, derivato dall’alga Klebsormidium nitens, ha attirato un’attenzione particolare per la sua struttura e funzionalità. L’analisi della struttura di KnChR è stata eseguita tramite crio-microscopia elettronica (cryo-EM), consentendo una risoluzione di 2,7 Å. L’analisi ha rivelato che KnChR presenta un dominio rhodopsin a 7 eliche trasmembrana e include un’architettura unica nella sua regione C-terminale, implicata nella modulazione allosterica dell’attività del canale. La presenza del retinal, legato covalentemente al residuo di lisina K254 per formare la base di Schiff del retinal (RSB), gioca un ruolo cruciale nella fotoattivazione del canale. È stato osservato che la configurazione 6-s-cis del retinal è centrale per il blu-shifting delle lunghezze d’onda di assorbimento, comportandosi in modo diverso rispetto ai canali ChR più comuni. In particolare, la regione N-terminale di KnChR adotta una configurazione allungata, priva di eliche α, e stabilizzata da interazioni elettriche tra residui di istidina ed acido glutammico, conferendo stati di energia significativamente diversi rispetto ad altri canali ionici. Tali caratteristiche morfologiche rendono KnChR un modello interessante per studiare la sintonizzazione del colore nei canali ionici e per applicazioni future nella tecnologia optogenetica.

Processo di eccitazione blue-shifted

Abbiamo inizialmente cercato di modellare il retinal all-trans (ATR) nella densità osservata, ma ci siamo resi conto che inserire correttamente il gruppo β-ionone risultava problematico. Abbiamo quindi deciso di adattare un modello di retinal 6-s-cis, che si è rivelato facilmente adattabile alla densità elettronica. A differenza di ATR, dove il gruppo β-ionone rimane in un piano con la catena poliena, nel retinal 6-s-cis tale gruppo subisce una rotazione di circa 140°, determinata da torsioni attorno al legame C6–C7. Nella letteratura, il legame C6–C7 dei channelrhodopsins è noto per la sua capacità di rotazione, i cui effetti possono influire notevolmente sulle lunghezze d’onda di assorbimento. Nel caso dello KnChR, riscontri sperimentali mostrano che l’assenza di torsione favorisce la stabilità della conformazione 6-s-cis, quindi contribuisce ad un blu-shifting nell’assorbimento spettrale. Effettuando mutazioni mirate, come il doppio mutante A157T/A161G, è emerso un red shift di 20 nm rispetto al tipo selvatico, a sottolineare il contributo di questi residui alla stabilizzazione della conformazione 6-s-cis e il loro impatto sulla dinamica di eccitazione. La confusione tra i gruppi metilici e i residui circostanti rivela come l’ambiente molecolare si interfacci con la rotazione del retinal, enfatizzando conclusioni importanti sulla base strutturale del blu-shifting. La conferma di interazioni dirette tra residui specifici e il retinal in KnChR suggerisce un processo di eccitazione dove la sterica gioca un ruolo crucialmente selettivo, rafforzando ulteriormente il potenziale di KnChR per diverse applicazioni optogenetiche.

Percorso ionico di KnChR

Nei canali di tipo channelrhodopsin, come il KnChR, i percorsi ionici sono strutturati attraverso le eliche trasmembrana (TM) 2, 3, 6 e 7, presentando tre siti di restrizione che regolano la permeazione degli ioni: il sito intracellulare (ICS), la parte centrale della membrana (CCS) e il sito extracellulare (ECS). Nel caso di KnChR, è evidente che la conformazione del percorso ionico varia significativamente rispetto a CrChR2. A differenza di quest’ultimo, dove l’ECS è distinto da due volumi extracellulari, KnChR presenta un volume extracellulare unificato, poiché la posizione di Q117 è sostituita da P115. Questa modifica strutturale ha l’effetto di semplificare l’architettura del percorso ionico e potrebbe influenzare la conduttanza e i tassi di chiusura del canale. Inoltre, un’analisi dettagliata del sito centrale di KnChR rivela due carboxilati, E121 e D250, che stabilizzano la carica positiva della base di Schiff del retinal. Queste interazioni non solo conferiscono stabilità, ma facilitano anche l’attraversamento di ioni, in particolare di ioni calcio, notoriamente più permeabili in KnChR rispetto ad altri canali. Guardando al sito ICS, i residui E79, H261 e R265 definiscono un’architettura protratta che divide il volume intracellulare in due porzioni distinte. La mutazione di E79 dimostra un impatto quantificabile sui tempi di chiusura del canale, sottolineando così il ruolo cruciale di questo protocollo ionico nella regolazione della dinamica del canale. L’analisi combinata di questi aspetti strutturali e funzionali evidenzia come il percorso ionico di KnChR si discosti dalle configurazioni tipiche, proponendo un modello innovativo per lo studio delle permeabilità ioniche nei canali rettificatori e la loro potenziale applicazione nell’optogenetica.

Ruolo della regione C-terminale

La regione C-terminale del KnChR gioca un ruolo fondamentale nella modulazione dell’attività del canale. Questa regione, estesa e ricca di interazioni con altre porzioni del canale, è cruciale per la dinamica del canale e la risposta alla luce. È stato osservato che la mutazione del residuo R287 all’interno della C-terminale aumenta notevolmente la durata dell’apertura del canale e amplifica il corrente, evidenziando l’importanza di questo residuo nella modulazione elettrostatica del canale. Le interazioni tra R287 e i residui E196 ed E285 sono state identificate come particolarmente rilevanti, poiché la modifica elettrostatica di R287E conduce a un incremento della corrente photocurrent del 220% e a una riduzione significativa dei tassi di chiusura del canale. D’altra parte, il residuo R291, meno coinvolto nelle interazioni interne, mostra anch’esso un effetto importante sulla durata dell’apertura del canale, sebbene il suo meccanismo di azione sembri focalizzarsi più sulla stabilizzazione della regione C-terminale attraverso legami con lipidi di membrana. Gli studi suggeriscono che la struttura della regione C-terminale, possedendo una notevole flessibilità, permette una modulazione allosterica attraverso le interazioni con transmembrana e l’alterazione della configurazione del canale sotto stimoli luminosi. Questa interazione unica distingue KnChR da altri channelrhodopsins, rendendolo un modello ideale per terremoto delle proprietà di modulazione nei canali. Questi risultati sono fondamentali per comprendere i meccanismi di attivazione e chiusura del canale, aprendo nuove prospettive nell’ottimizzazione delle applicazioni optogenetiche.

Caratterizzazione ottogenetica e di tuning del colore

La caratterizzazione ottogenetica del KnChR ha rivelato notevoli possibilità per le applicazioni nel campo delle neuroscienze, con un focus particolare sui mutanti a spostamento blu. La strategia principale ha coinvolto la progettazione mirata di mutazioni nei residui A157 e A161, i quali sono stati identificati come cruciali per la configurazione 6-s-cis del retinal. L’introduzione della mutazione A157G ha portato a uno spostamento verso il blu di 10 nm, riducendo l’interferenza sterica con il gruppo metilico C16 e favorendo ulteriormente la stabilità della configurazione desiderata. Inoltre, il mutante I129Q, omologo del noto “L/Q switch”, ha presentato un significativo spostamento di 30 nm verso il blu, grazie alla sua interazione polare con la base di Schiff, suggerendo una regolazione fine della lunghezza d’onda di assorbimento. Queste variazioni sono state esaminate mediante registrazioni elettrofisiologiche, in cui KnChR-272 ha dimostrato alta capacità di eccitazione con luce a 423 e 469 nm, generando potenziali d’azione in condizioni controllate. In particolare, la luce a 385 nm ha evidenziato un’efficace attivazione delle cellule neuronali, con probabilità di picco superiori al 90%. Tali risultati suggeriscono che KnChR non solo è in grado di rispondere a stimoli luminosi a lunghezze d’onda brevi, ma è anche compatibile con altri strumenti ottogenetici. La combinazione di KnChR con sensori di calcio geneticamente codificati, come R-GECO o RCaMP, offre opportunità promettenti per esperimenti di monitoraggio e manipolazione neuronale. Questa ricerca pone così le basi per l’ottimizzazione e l’ampliamento delle applicazioni ottogenetiche, rendendo KnChR un candidato fondamentale per studi futuri sui circuiti neuronali complessi.